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慢病毒包装、滴度检测及细胞感染技术原理
一、慢病毒包装
采用三质粒慢病毒包装系统：干扰慢病毒系统选用 pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G 质粒组合，过表达慢病毒系统选用 pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G 质粒组合。将对应质粒充分混匀后，通过磷酸钙转染法导入 HEK293T 细胞，继续培养 48h 后收集细胞培养上清液。经纯化处理后，取部分样品进行病毒滴度检测，剩余病毒液置于 -80℃冰箱中冻存备用。
二、滴度检测
将纯化后的病毒颗粒进行梯度稀释，随后分别感染 293T 细胞。感染后培养 72h，利用荧光显微镜观察并记录细胞的荧光表达情况，依据阳性荧光细胞数量及荧光强度计算病毒滴度。
三、细胞感染
病毒感染前 1 天对目标细胞进行计数，按每孔约 10000 个细胞的密度接种至 12 孔板，培养过夜。次日采用无血清培养基稀释病毒液，加入 12 孔板中进行细胞感染；病毒用量根据目标细胞推荐的感染复数（MOI）确定，若无推荐 MOI 值，则设置 1、5、10、50、100 五个梯度进行感染优化。感染 6h 后，移除含病毒的培养基，更换为完全培养基继续培养 48h，通过荧光显微镜观察细胞荧光强度以验证感染效果。同时加入嘌呤霉素（puromycin）进行稳定细胞株筛选，筛选周期约 2 周。筛选获得稳定细胞株后，采用定量 PCR 技术检测目的基因的转录水平，通过 Western blot 技术检测目的蛋白的表达水平，以确认目的基因的稳定表达。
实验方法
二、关键技术要点与注意事项
（一）MOI相关要点
MOI（multiplicity of infection，感染复数）指感染时病毒与细胞的数量比值。多数细胞的推荐MOI可通过查阅文献获取，但受实验室环境、病毒批次及测算方法差异影响，不同来源的MOI参考价值有限。因此，建议针对自行包装的慢病毒，单独开展预实验检测适配目标细胞的MOI值，以保障感染效果。
（二）单克隆稳定细胞株筛选要点
为获得最佳质量的单克隆稳定细胞株，可通过增大筛选样本总量的方式，提升筛选到高纯度、高稳定性阳性克隆的概率。
（三）全流程操作关键注意事项
慢病毒介导的稳定细胞株构建流程复杂，各环节操作的严谨性直接决定实验成功率，核心注意事项如下：
1. 载体构建阶段：需反复校对目的基因序列，避免出现移码突变；载体与目的片段连接后，需通过菌落PCR、测序等方式验证插入方向及序列完整性，排除假阳性克隆。
2. 病毒包装阶段：确保293T等包装细胞处于对数生长期，以保障高转染效率；精准优化转染试剂与质粒的比例，减少细胞毒性；收集病毒上清时，需经多次低速离心去除细胞碎片，后续及时进行病毒浓缩与纯化，避免病毒滴度随时间下降。
3. 细胞感染阶段：通过预实验摸索最佳MOI值，防止因感染过度导致细胞死亡或感染不足影响实验效率；实验中需设置未感染细胞（阴性对照）、空载病毒感染细胞（阳性对照），排除背景干扰；感染后经嘌呤霉素筛选获得稳定细胞株，需定期检测目的基因表达水平，避免出现基因沉默或丢失，保障细胞株质量稳定可靠。
