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耐药肿瘤细胞株构建相关说明
一、应用简介
肿瘤细胞（癌细胞）的耐药性是肿瘤（癌症）难以根治的关键原因之一。体外构建的耐药细胞株，可模拟肿瘤细胞（癌细胞）对特定药物耐药性的形成过程，不仅有助于深入解析肿瘤细胞（癌细胞）获得耐药性的分子机制，还能为抗耐药特异性药物的筛选提供重要工具，进而支撑相关疾病的精准临床治疗。
二、原理介绍
当药物作用于某类细胞时，会选择性杀伤敏感细胞，而少量具有抗性的细胞可存活并大量增殖产生抗性后代。此时再次使用该药物，药效会显著下降，这一现象即为细胞耐药性。本研究采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击法，诱导肿瘤细胞对特定药物产生耐药性，最终构建出针对该药物的耐药肿瘤细胞株。
三、实验方法
（一）亲本细胞株IC??检测
IC??（half maximal inhibitory concentration，半抑制浓度），指某物质对特定生物程序产生50%抑制效果时的浓度。在细胞增殖研究中，可理解为药物对细胞增殖的抑制效果达到正常增殖水平50%时的药物浓度。IC??是衡量药物细胞毒性及细胞药物耐受能力的关键指标，广泛用于药物实验中药物浓度的评估。常用的IC??计算工具包括Excel、GraphPad Prism、SPSS等。
（二）药物诱导耐药：浓度递增法联合大剂量间断冲击法
核心原则：通过逐步提升药物浓度或阶段性大剂量冲击，筛选存活的抗性细胞并传代培养，最终获得稳定耐药的细胞株。
1. 大剂量间断冲击法
将对数生长期的肿瘤细胞接种于培养瓶，培养至70%～80%汇合度时，加入设定浓度的药物培养液孵育。孵育结束后，弃去含药培养液，用PBS缓冲液清洗细胞2遍，更换无药培养基常规培养，直至细胞恢复生长。待细胞稳定生长并进入对数生长期后，传代2次，再用相同浓度药物重复上述培养流程。逐步延长药物作用时间，依次设置1h、2h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h共10个作用时间段，全程培养约8个月。最终筛选出可在特定浓度药物培养液中持续稳定生长并传代的细胞，随后进行1个月的脱药培养，后续检测其生物特性及耐药相关指标。
2. 浓度梯度递增间断冲击法
将对数生长期的肿瘤细胞接种于培养瓶，待细胞生长至60%～70%汇合度（对数期）时，加入起始低浓度药物培养液孵育24h。孵育结束后，弃去含药培养液，PBS清洗2遍，更换无药培养基培养至细胞恢复生长，消化传代后再次用相同低浓度药物冲击24h。待细胞增殖恢复正常形态后，重复上述药物冲击流程，每种浓度连续冲击8次。当细胞在该浓度下稳定生长后，逐步提高药物浓度并重复上述培养-冲击流程，药物浓度按设定梯度依次递增。全程诱导培养约9个月，直至细胞可在目标浓度药物中稳定生长。
（三）耐药细胞株IC??检测与耐药性验证
采用与亲本细胞相同的方法检测耐药细胞株的IC??值，通过计算耐药指数（resistance index, RI）评估耐药性：RI=耐药细胞株IC??/亲代细胞株IC??。当RI>5时，判定该耐药细胞株的耐药性符合实验要求。
四、关键操作要点与鉴定规范
耐药细胞株构建需平衡细胞适应性与耐药特性，各环节需精准把控，核心要点如下：
1. 起始阶段：优先选择对数生长期、状态良好的亲本细胞，确保其遗传背景清晰、无微生物污染，为耐药诱导奠定良好基础。
2. 诱导阶段：① 化疗药物（如顺铂、紫杉醇）梯度递增设置：起始浓度建议为亲本细胞IC??的1/5-1/10，每周浓度递增幅度控制在10%-20%，避免浓度骤升导致细胞大量死亡；② 设置平行对照：同步培养未加药处理的亲本细胞，用于对比分析细胞生长曲线及耐药表型差异；③ 过程监测：诱导周期通常为2-6个月，期间定期更换培养液，持续观察细胞形态、增殖速率变化，避免细胞因代谢压力过大出现老化或凋亡。
3. 鉴定阶段：① 耐药性验证：采用MTT法、IC??测定、Western blot等技术综合验证；② 分子机制检测：检测耐药相关蛋白（如P-糖蛋白P-gp）及耐药基因（如ABCB1）的表达水平；③ 细胞生物学特性分析：利用流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡率变化；④ 稳定性保藏：构建成功的耐药细胞株需定期传代，并及时进行液氮冻存，避免长期体外培养导致耐药性减弱，保障细胞株稳定性及后续实验结果的可靠性。
