细胞侵袭

肿瘤细胞侵袭实验详解

一、应用简介

肿瘤细胞的侵袭过程遵循特定的三步循环机制：首先，肿瘤细胞通过细胞膜表面的特定受体，与细胞基质或基底膜中的层粘连蛋白、纤维连接蛋白及Ⅳ型胶原等成分发生粘连；随后，肿瘤细胞可释放蛋白水解酶，或激活基质中已存在的酶原，促使基质成分降解；最后，肿瘤细胞通过运动填充至被水解的基质空隙中。上述过程不断重复，推动肿瘤细胞向组织深层持续侵袭。

二、技术原理

本实验采用Matrigel基质胶构建体外侵袭模型，该基质胶提取自小鼠EHS肉瘤，主要成分包含层粘连蛋白（LN）、Ⅳ型胶原等天然基底膜组分。实验中将Matrigel均匀铺覆于Transwell侵袭小室的多孔滤膜上，其可自行形成与天然基底膜结构高度相似的模拟屏障。在趋化剂的诱导作用下，具有侵袭能力的肿瘤细胞可穿透该模拟屏障及多孔滤膜；对侵袭至滤膜另一侧的细胞进行染色后，通过显微镜观察并计数，即可评估细胞的侵袭能力。

三、实验方法

本实验核心流程为细胞侵袭实验，具体操作流程如下：

（可根据实际操作步骤补充：如Matrigel铺胶、细胞接种、趋化诱导、孵育培养、固定染色、观察计数等详细步骤）

四、注意事项

1. 照相前需确保小室滤膜完全晾干；照相时将小室正面朝下置于载玻片上，在倒置显微镜下进行观察与成像。

2. Matrigel使用前需从-20℃环境转移至4℃冰箱中自然融化（建议过夜放置），全程避免反复冻融，以防破坏其生物活性。

3. 所有需接触Matrigel的实验器具（如试管、移液吸头等）均需提前在4℃冰箱中预冷，避免因温度过高导致基质胶提前凝固。

4. Matrigel操作全程需严格遵循无菌操作规范，防止污染影响实验结果。

五、实验关键要点

细胞侵袭实验的核心在于精准模拟体内微环境，并最大限度保证实验数据的准确性，各关键环节需严格把控：

1. 铺胶操作：Matrigel基质胶需提前预冷，全程置于冰上操作；按实验需求比例稀释后，均匀铺覆于Transwell小室滤膜上，铺胶过程中需避免产生气泡；随后置于37℃培养箱中孵育，待基质胶完全凝固，形成致密的细胞外基质模拟屏障。

2. 细胞接种：细胞密度的精准调整至关重要——密度过高易导致细胞间营养竞争，干扰侵袭结果；密度过低则会增大数据误差，建议每小室接种1×10?~5×10?个细胞。同时需严格控制小室上下腔的培养液成分差异：下腔需添加含血清或趋化因子的培养基，形成有效的趋化梯度，为细胞定向迁移提供动力。

3. 后续处理与观察：实验结束后的固定、染色操作需轻柔，避免损伤小室膜上的细胞；染色前需用棉签小心擦除滤膜上未侵袭的细胞，确保仅对穿透滤膜的细胞进行染色。显微镜观察时，需选取多个随机视野进行细胞计数并取平均值，以减少主观误差。此外，实验需设置阳性对照（如选用已知高侵袭能力的细胞系）与阴性对照，验证实验体系的有效性。