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酶联免疫吸附实验（ELISA）技术介绍
一、应用简介
酶联免疫吸附实验（ELISA）是将已知抗原或抗体吸附于固相载体表面，使酶标记的抗原-抗体特异性反应在固相表面进行的免疫检测技术。该技术可精准检测大分子抗原、特异性抗体等目标物质，具备快速灵敏、操作简便、载体易标准化等显著优势，广泛应用于生物医学检测、临床诊断等领域。
二、技术原理
ELISA的核心原理是利用抗原与抗体的特异性结合反应，将待测物与酶分子连接，通过酶催化底物发生显色反应实现定量测定，检测对象可分为抗体或抗原两类。实验需依赖三种关键试剂：①固相化的抗原或抗体（免疫吸附剂）；②酶标记的抗原或抗体（标记物）；③酶催化反应的底物（显色剂）。
具体反应流程为：首先将抗原（或抗体）结合于固相载体表面，其免疫活性保持不变；随后加入酶标记的抗体（或抗原）偶联物（标记物），该偶联物同时保留免疫活性与酶活性，可与固相载体上的抗原（或抗体）特异性结合；最后加入对应底物，酶会催化底物发生水解或氧化还原反应并产生颜色。反应生成的颜色深浅与待测抗原（或抗体）的含量呈正相关，可通过肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，或采用分光光度计（酶标仪）进行精准定量检测。该方法兼具操作简便、快速高效、特异性强等特点。
三、实验方法
1. ELISA检测核心流程
核心环节：ELISA检测（含包被、加样、温育、洗涤、显色、终止、读数等关键步骤）
四、技术总结
1. 将可溶性抗原或抗体吸附于固相载体形成不溶形式，是ELISA检测的基础前提。实验中最常用的固相载体为聚苯乙烯或聚氯乙烯材质的微量反应板及塑料管。
2. 包被用抗原需满足可溶性、优质稳定的要求，且需具备高纯度和高免疫原性。若抗原纯度不足，其中的杂质会竞争固相载体上的有限结合位点，导致检测敏感性和特异性下降。
3. 部分抗原需经提纯处理后方可使用，例如病毒组织培养物、鸡胚培养物及病毒接种动物的脏器等样本，其中含大量非抗原性蛋白质，需通过梯度超速离心或亲和层析等方法去除杂质，未提纯的样本不可直接用于实验。
4. 采用最适稀释度的抗原包被固相载体，不仅可降低实验成本，还能有效避免前带现象。最适包被浓度可通过棋盘滴定法测定，单项滴定法更为简便：将抗原进行系列稀释后包被微量反应板，加入固定稀释度的阳性参考血清与阴性参考血清孵育洗涤，再加入酶结合物反应，经孵育洗涤后加底物显色，终止反应后测定OD值，选择OD值≥1.0对应的抗原稀释度作为最适包被浓度。
5. 抗原包被固相载体的效果，除与抗原浓度相关外，还受包被时间、温度及pH值影响。温度升高（如37℃、45℃或56℃）可缩短包被时间，低温环境则需延长包被时间以保证包被效果。
五、关键操作规范
ELISA检测的准确性取决于严谨的操作流程和细节把控，核心规范如下：
1. 实验前准备：确保试剂盒在有效期内，提前将所有试剂平衡至室温，避免温差引发检测误差；选用洁净无酶残留的耗材，优先使用一次性吸头，防止交叉污染。
2. 加样操作：严格控制加样体积与速度，避免产生气泡或液体挂壁，防止样本间相互干扰；加样后及时轻拍反应板使液体混合均匀，避免剧烈震荡破坏抗原-抗体结合。
3. 温育控制：温育是抗原-抗体特异性结合的关键环节，需严格遵循试剂盒说明书控制时间与温度；使用恒温箱时，避免反应板直接接触箱壁以防受热不均；若采用水浴温育，需密封反应板，防止液体蒸发影响结果。
4. 洗涤与显色：洗涤步骤直接影响检测背景，需充分去除未结合物质，但洗涤次数与力度需适中，过度洗涤可能导致抗原-抗体复合物解离；底物显色需在避光条件下进行，严格控制显色时间，避免颜色过深超出线性范围。
5. 结果读取与质量控制：终止反应后需尽快用酶标仪读数，防止吸光度值随时间漂移；实验需同步设置空白对照、阴性对照及阳性对照，全面验证结果的可靠性。
