核酸提取

核酸提取技术介绍

一、应用简介

核酸提取是分子生物学研究的基础核心环节，高质量的核酸对于分子生物学相关应用至关重要。核酸提取技术为各类广泛的研究与应用提供了关键支撑（例如克隆、qRT-PCR，以及全基因组、转录组研究中的二代测序技术等）。所获得的核酸可通过多种方式应用于基础研究与疾病研究中的基因表达分析、药物治疗反应跟踪、新物种识别与进化过程深入探究、疾病诊断等多个领域。

二、技术原理

核酸作为贮存与传递遗传信息的关键生物大分子，是分子生物学研究的核心对象。常规采用吸附柱法抽提样本中的DNA与RNA，为下游实验提供高纯度、高浓度的实验模板，保障后续实验的顺利开展。

DNA提取方法：基因组DNA提取主要采用CTAB法、SDS法，以及玻璃珠法、酶法等其他方法；质粒DNA提取以碱裂解法和煮沸法为主；线粒体、叶绿体DNA提取则多采用差速离心结合SDS法。

RNA提取方法：核心为异硫氰酸胍/苯酚法。基本实验原理为：细胞在变性异硫氰酸胍的作用下发生裂解，核酸释放；在特定pH条件下，DNA与RNA的溶解度存在差异，分别处于体系的中间相和水相，从而实现分离；后续通过有机溶剂抽提、沉淀等步骤，最终获得纯净的RNA。

三、实验方法

1. 核酸提取核心流程

核心环节：核酸提取（含样本处理、细胞裂解、核酸分离、纯化、沉淀、洗涤、洗脱等关键步骤）

四、技术总结

1. 细胞裂解法分类

物理方式：包括煮沸法、玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法、匀浆法等；

化学方式：主要有表面活性剂法（如SDS法）、碱裂解法等；

生物方式：以酶法为主，常用酶类包括溶菌酶、蛋白酶K等。

2. 常见样本提取方法

（1）浓盐法：利用RNA与DNA在盐溶液中溶解度的差异，实现二者的分离纯化。

（2）有机溶剂提取法：以有机溶剂作为蛋白变性剂，在使蛋白质变性的同时，抑制核酸酶的活性，避免核酸被降解，从而实现核酸的分离。

（3）密度梯度离心法：依据样本中不同成分密度的差异，通过离心作用分离出包括核酸在内的各类成分。

（4）吸附材料结合法：①硅质材料：在高盐、低pH值条件下结合核酸，在低盐、高pH值条件下洗脱核酸；②阴离子交换树脂：在低盐、高pH值条件下结合核酸，在高盐、低pH值条件下洗脱核酸；③磁珠法：通过在磁珠微粒表面包裹特定基因，使其可特异性吸附不同目的物，进而实现分离。

（5）胍盐提取结合二氧化硅吸附法：二氧化硅具有特异吸附核酸的特性，而异硫氰酸胍可促使细胞裂解。因此，在高浓度异硫氰酸胍存在的条件下，从细胞（包括细菌）或病毒颗粒中释放的核酸成分可结合于二氧化硅上，利用这一特性可实现血液、尿液等样本中DNA与RNA的提取。

（6）TRIzol试剂提取RNA：采用TRIzol试剂裂解细胞后，加入氯仿并离心，体系会分层为三层：上层透明水相含RNA，中间层含DNA，下层红色有机相含蛋白质，通过分层可实现RNA的初步分离。

（7）离心柱提取：属于硅吸附方法的一种，是用于微量核酸分离纯化的简易技术，原理分为三个核心部分：①利用裂解液促使细胞破碎，释放细胞内的核酸；②释放的核酸特异性吸附于特定硅载体上，该载体对核酸具有强亲和力与吸附力，而对蛋白质、多糖、脂类等其他生化成分基本不吸附，离心时此类杂质被甩出柱子；③用洗脱液将吸附于硅载体上的核酸洗脱，获得纯化的核酸。

（8）磁珠法：与硅胶膜离心柱原理一致，通过纳米技术对超顺磁性纳米颗粒表面进行改良与修饰，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠可在微观界面上与核酸分子特异性识别并高效结合。在离液盐（如盐酸胍、异硫氰酸胍等）和外加磁场的作用下，可从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA与RNA，广泛应用于临床疾病诊断、输血安全检测、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多个领域。

五、常见问题

1. 洗脱产物DNA量很少或没有

可能原因：样本中细胞浓度过低；样本裂解不充分；DNA吸附不充分。

2. DNA影响后续酶反应实验

可能原因：乙醇残留；解决方案：离心完成后，将吸附柱置于室温或温箱中放置2min左右，彻底去除残留乙醇。

3. 核酸降解

可能原因：样本不新鲜（对RNA而言尤为关键）；前处理不当（如样本量过大）。

六、关键操作规范

核酸提取过程易受多种因素干扰，需从样本处理到最终保存全流程精细把控，核心规范如下：

1. 样本管理：样本采集后应尽快处理，若无法及时提取，需使用专用保存液低温保存，避免核酸降解；组织样本需充分研磨破碎，细胞或细菌样本需确保完全裂解，例如革兰氏阳性菌需提前用溶菌酶预处理。

2. 污染防控：操作过程中需严格防止污染，选用无核酸酶的耗材与试剂，操作人员需佩戴手套、口罩，必要时在超净台或通风橱内进行操作；RNA提取需全程使用RNase-free产品，避免RNase（RNA酶）降解RNA。

3. 裂解与纯化：裂解时需精准控制裂解液用量与作用时间，防止过度裂解导致核酸断裂；纯化过程中，酚-氯仿抽提需充分离心分层，避免吸入中间蛋白层；乙醇沉淀环节需使用预冷乙醇，并置于低温环境放置，提高核酸回收率。

4. 洗涤与干燥：用70%乙醇洗涤核酸沉淀时操作需轻柔，防止核酸丢失；干燥核酸时避免过度干燥，以免导致核酸变性。

5. 检测与保存：提取完成后需立即检测核酸浓度与纯度，可通过分光光度计或荧光定量法测定，并采用琼脂糖凝胶电泳验证核酸完整性；提取产物需低温分装保存，-20℃可用于短期存放，-80℃适合长期保存，全程避免反复冻融。