CRISPRCas9技术

CRISPR/Cas9基因编辑技术介绍

一、应用简介

简单来说，CRISPR/Cas9是一种可对细胞及生物体内基因进行编辑的分子生物学技术。基因编辑即通过特定生物手段与技术，修改生物体内的遗传物质。该技术基于原核生物获得性免疫系统研发，核心包含两种关键成分：一是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，二是具备导向功能的sgRNA（单导向RNA）。

当细胞内同时表达sgRNA与Cas9蛋白时，Cas9蛋白会与sgRNA结合，精准靶向目的DNA序列并发挥双链切割作用。DNA序列被切割产生断裂后，会触发细胞内的DNA修复机制（DNA repair）。真核细胞中存在同源重组修复和非同源末端连接修复两种方式：同源重组修复中，断裂的染色体以另一条完整的姐妹染色单体为模板进行修复；非同源末端连接修复中，断裂的DNA会随机连接修复，可能引入新碱基，导致基因产生移码突变。

二、技术原理

CRISPR/Cas9系统的核心工作原理为：crRNA（CRISPR衍生RNA）通过碱基配对与tracrRNA（反式激活RNA）结合形成tracrRNA/crRNA复合物，该复合物可引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA互补的靶序列位点剪切双链DNA，实现基因组DNA序列的编辑；通过人工设计crRNA与tracrRNA，可构建具有引导功能的gRNA（引导RNA），进而引导Cas9蛋白对DNA进行定点切割。

靶位点选择要求

1. 靶位点核心序列为20个碱基，且该序列下游需紧邻NGG型PAM区；

2. 靶位点优先选择在基因编码区前端；

3. 转化过程需选用对应抗性的LB平板培养基进行筛选。

三、实验方法

1. CRISPR/Cas9基因编辑核心流程

核心环节：CRISPR/Cas9基因编辑（含sgRNA/gRNA设计与构建、载体构建、细胞转染/病毒感染、基因编辑效率检测、阳性细胞筛选与鉴定等关键步骤）

四、技术总结

4.1 CRISPR/Cas9慢病毒特点

1. 适用于同一细胞系中多基因敲除实验；

2. 基因敲除效率高于直接质粒转染；

3. 提供多种荧光标记与抗性标记的慢病毒表达载体，便于筛选基因敲除成功的细胞；

4. 可定制Cas9蛋白稳定表达的不同细胞系。

4.2 CRISPR/Cas9腺病毒特点

1. 可感染多种分裂期与非分裂期细胞，感染效率与敲除效率均较高；

2. 操作流程简单，易于掌握；

3. 基因敲除周期短，实验成本较低；

4. 适用于哺乳动物不同种属、不同基因的编辑操作，应用范围广泛。