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荧光定量PCR技术介绍
一、应用简介
荧光定量PCR是检测生物样品中RNA含量的常用核心方法。该技术通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记与跟踪，实时在线监控反应全过程；结合配套分析软件对产物信号进行分析，可精准计算待测样品模板的初始浓度。目前，检测RNA含量主要采用SYBR Green法与TaqMan法。
二、技术原理
1. SYBR Green Ⅰ法
SYBR Green Ⅰ是一种仅与DNA双链结合的荧光染料，其核心特性为：与DNA双链结合时发出强荧光，从DNA双链解离后荧光信号急剧减弱，因此反应体系内的荧光信号强度可直接反映双链DNA分子的数量。
SYBR Green荧光染料定量PCR的基本流程：①反应启动，SYBR Green染料与体系中的DNA双链结合，产生荧光信号；②DNA变性阶段，双链解开，SYBR Green染料释放，荧光信号急剧下降；③聚合延伸阶段，引物退火结合模板并合成PCR产物；④聚合反应完成后，SYBR Green染料与新合成的双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光净增量显著升高。
2. TaqMan探针法
TaqMan探针法的核心是特异性探针分子。TaqMan探针为单链DNA，其5’端偶联发光基团，3’端偶联淬灭基团；游离状态下的完整探针无法检测到荧光信号，因发光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收淬灭，仅当探针被水解，发光基团与淬灭基团分离时，才能检测到荧光信号。
具体反应过程：反应初始，模板链经热变性解链为单链；TaqMan探针优先与模板链退火结合，随后引物退火结合于模板；链延伸阶段，Taq酶发挥5’-3’外切酶活性，遇到探针时从5’端逐碱基切除探针，使发光基团与淬灭基团分离；荧光检测系统可实时接收到荧光信号，且每扩增一条DNA链就会形成一个荧光分子，荧光信号的累积与PCR产物的生成同步进行。
TaqMan探针法的特异性不仅由引物保障，更由探针分子强化——因探针退火温度更高，特异性更优。在同一反应体系中加入多条特异性探针，可实现多个基因的同步检测。
三、实验方法
1. 核心检测方法
TaqMan探针法（含样品制备、引物探针设计、反应体系配制、实时扩增检测、结果分析等关键步骤）
四、技术总结
4.1 引物与探针设计规范
1. 引物序列应选取基因的保守区段，确保特异性结合；
2. TaqMan探针技术要求扩增片段长度控制在50bp-150bp；
3. 避免引物自身形成环状发卡结构，同时避免引物自身或引物之间形成4个及以上连续碱基配对；
4. 引物长度通常为18-24个核苷酸：长度需足够保证序列独特性，降低与非目的序列结合的概率；但长度超过24个核苷酸不代表特异性更高，较长序列可能与错误配对序列杂交，降低特异性且减慢杂交速度，进而影响扩增产量；引物Tm值应在55-65℃，GC含量为40%-60%；
5. 成对引物之间的Tm值差异需控制在2℃以内；
6. 引物3’端避免出现3个及以上连续相同的碱基；
7. 为避免基因组DNA扩增干扰，引物设计优先跨两个外显子；
8. 探针位置应尽可能靠近上游引物；
9. 探针5'端避免使用G碱基，引物3’端避免使用A碱基；探针长度通常为25-35bp，Tm值在65-70℃（通常比引物Tm值高5-10℃），GC含量为40%-70%；
10. 整条探针中，C碱基含量需明显高于G碱基含量；
11. 为保障引物与探针的特异性，设计完成后需在Blast中进行序列核实；若发现存在非特异性互补区域，建议重新设计。
4.2 热启动PCR
热启动PCR是除优质引物设计外，提升PCR特异性的关键方法之一。
1. 镁离子浓度调控
镁离子对PCR反应多个环节存在影响：一方面影响DNA聚合酶活性，进而影响扩增产量；另一方面影响引物退火效率，进而影响反应特异性。若dNTP与模板DNA结合镁离子，会降低酶活性所需的游离镁离子浓度，需精准调控体系中镁离子的终浓度。
2. 模板质量控制
模板质量直接影响扩增产量。DNA样品中可能存在多种污染物，这些污染物会抑制PCR反应，需保证模板纯度。
五、 残余污染防控
1. PCR技术具有高敏感性，易受污染影响：少量外源DNA污染即可与目的模板一同被扩增。若将前一次扩增产物用于新的扩增反应，会发生同源污染（即残余污染）；此外，从其他样品中纯化的DNA或克隆DNA也可能成为污染源（非残余污染）。
2. 可通过规范实验操作减少残余污染：为PCR样品配制与扩增后分析设置独立隔离区域；准备新反应前更换手套；始终设置无模板阴性对照以检测污染情况；使用预混合反应组分，而非为每个反应单独添加各试剂。
