DNA甲基化检测

DNA甲基化检测技术介绍

一、应用简介

DNA甲基化是基因表达调控的重要机制之一，DNA甲基化检测是指通过各类技术方法测定肿瘤细胞DNA甲基化程度的检测手段。在恶性肿瘤发展进程中，DNA甲基化状态并非恒定不变：肿瘤细胞全基因组的低甲基化程度与疾病进展、肿瘤大小及恶性程度密切相关。因此，DNA甲基化检测对判断肿瘤恶性程度具有重要参考价值。

二、技术原理

DNA甲基化检测的核心基础是：基于DNA甲基化状态的差异性，通过特异性处理与扩增技术，区分并检测甲基化与非甲基化位点。以下为两种常用检测方法的具体原理：

1. 甲基化特异性PCR（Methylation-specific PCR，MSP）

该方法由Herman等人于1996年在重亚硫酸盐处理技术的基础上建立，具有高敏感性，主要用于甲基化定性研究。核心原理为：采用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，使所有未发生甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶保持不变；随后分别设计针对甲基化序列和非甲基化序列的特异性引物进行PCR扩增。通过电泳检测MSP扩增产物：若针对处理后甲基化DNA链的引物能扩增出目的片段，说明该检测位点存在甲基化；反之，则说明该位点无甲基化。

特点：适用范围广泛，可精准检测特异位点是否发生甲基化。

2. 亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

该方法由Frommer等人于1992年提出，是研究DNA甲基化的经典方法，具有高可靠性与高精确度，可明确目的片段中每个CpG位点的甲基化状态。核心原理为：用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，甲基化胞嘧啶则保持不变；随后设计BSP特异性引物进行PCR扩增，扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶（T）；最后通过对PCR产物测序判断CpG位点的甲基化状态，此为BSP-直接测序法。若将PCR产物克隆至载体后再进行测序，可提高测序成功率，该方法称为BSP-克隆测序法。

特点：精确度高，可准确检测出目标区域的甲基化程度百分比。

三、实验方法

1. 核心检测方法

核心环节：DNA甲基化检测（含基因组DNA提取、亚硫酸氢盐处理、特异性引物设计、PCR扩增、产物检测/测序等关键步骤），常用方法包括MSP法、BSP法等。

四、常见问题

1. 如何确定基因的目标区域进行甲基化分析？

转录起始位点附近的CpG岛是DNA甲基化分析的首选区域，该区域通常位于基因的启动子区或5’UTR区（5’非编码区）。

2. 为何文献报导的甲基化序列不在CpG岛中？

不存在明显的CpG岛，并不意味着该区域不会发生甲基化。甲基化也可能发生在CG位点不密集的区域。

3. BSP甲基化扩增得到的PCR产物可否直接测序？为何需要构建TA克隆后测序？

不建议直接对PCR产物测序。若直接测序，可能在原始的C位点出现双峰图（分别对应甲基化的C和未甲基化的T），无法准确判断该位点的甲基化程度；而将PCR产物构建TA克隆后测序，可明确单个克隆的序列信息，进而精准确定甲基化程度。