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TUNEL染色相关说明
TUNEL染色全称为原位末端转移酶标记技术。当细胞发生凋亡时，其DNA会出现双链断裂或单链缺口，进而产生一系列3’-OH末端。在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，可将脱氧核糖核苷酸与生物素形成的衍生物标记到这些DNA的3′末端，从而实现对凋亡细胞的检测。作为一种结合分子生物学与形态学的研究方法，TUNEL染色能够对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位标记，精准反映细胞凋亡最典型的生物化学与形态学特征。
技术原理
在晚期凋亡细胞中，染色体DNA的双链或单链断裂会产生粘性3'-OH末端。在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的催化作用下，可将带有生物素（Biotin）分子的dUTP标记到该DNA的3'-末端；随后，标记后的产物会与辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）相结合；最终通过DAB显色反应使凋亡细胞显色，借助普通光学显微镜即可观察到凋亡细胞。以上便是TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）法检测细胞凋亡的核心原理。
实验流程
关键实验步骤
1. 充分完成脱蜡与水化处理。脱蜡操作可先在60oC条件下孵育20分钟，再用二甲苯浸洗两次，每次5-10分钟；水化处理则采用梯度乙醇从高浓度向低浓度依次浸洗，确保后续结合反应能够充分、均匀地进行。
2. 精准把控细胞通透时间。通常需根据切片厚度选择蛋白酶K的孵育时长，常规范围为10-30分钟：几微米厚的切片可选择较短孵育时间，几十微米厚的切片则需延长时间。需通过预实验摸索最佳条件，以达到既不发生脱片，又能保证后续酶与抗体顺利进入细胞内的效果。
3. 合理延长TUNEL反应液的孵育时间。常规孵育条件为37oC、1小时，也可根据细胞凋亡损伤程度适当延长至2小时，但需同步关注最终染色结果的背景着色情况，避免背景过高影响观察。
4. 科学选择DAB显色条件。常规DAB反应时间约为10分钟，过程中需通过显微镜实时观察并控制背景颜色，最长反应时间不宜超过30分钟。此外，Promega公司提供的DAB显色液呈桃红色，不利于区分凋亡细胞的棕褐色阳性着色，不推荐使用。
5. 确保PBS充分清洗。在TUNEL反应后及酶标反应后的清洗步骤需严格执行，可将清洗次数增加至5次，该操作直接决定最终切片的非特异性着色程度，需重点关注。
6. 重视内源性过氧化物酶（POD）的封闭。对于肝脏、肾脏等血细胞含量较高的组织，建议适当延长封闭时间并提高过氧化氢浓度，以达到理想的封闭效果，同时不影响特异性染色结果。
实验结果展示
注意事项
1. 清洗蛋白酶K时，务必用PBS冲洗3次，若冲洗不彻底，会严重干扰后续标记反应的进行。
2. 使用3%过氧化氢溶液孵育时，时间不宜过长，否则可能导致过氧化氢诱导DNA断裂，产生假阳性结果。
3. 滴加TUNEL检测液时，可使用防蒸发膜避免液体蒸发，保证样本的生物素标记效果；配制好的DAB显色液需一次性用完，不可冷冻保存。
常见问题
问题1：无染色或染色微弱
可能原因：烤片温度过高（推荐烤片条件为56℃-60℃、1-2小时）；一抗与固定液、石蜡切片不匹配，或一抗使用浓度过低、孵育时间不足等。
问题2：染色过深
可能原因：染色试剂浓度过高或孵育时间过长；显色剂浓度过高或孵育时间过长。
送样运输要求
1. 石蜡切片：常温运输；组织需用标准石蜡包埋盒包埋，石蜡与组织结合均匀，无裂痕；蜡块厚度根据所需切片数量确定，有效厚度至少0.1cm；建议提供半年内制备的组织蜡块，超过半年的蜡块可能出现抗原丢失，导致免疫组化检测无法检出目标蛋白。
2. 冰冻切片：-20℃条件下运输；固定后的细胞爬片：4℃条件下运输。
