免疫组化染色

技术原理

免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

实验步骤

实验结果展示：

送样运输要求

石蜡切片制片：组织取样后需立即放入固定液，禁止对组织进行冻存处理。

冰冻切片制片：需选用新鲜组织进行制备，防止因组织放置过久出现抗原丢失。

标本保存期限：组织蜡块可长期保存；石蜡切片的保存时间理论上不宜超过半年，冰冻切片的保存时间则不应超过 3 个月。

注意事项

苏木素复染的时长需根据实验实际情况摸索确定，尤其是当目标阳性染色位点同样位于细胞核时，更需精准把控复染时间。

DAB 显色操作需实现时长最优化，应在显微镜下实时观察显色进度，以阳性染色清晰可辨且背景着色较浅为最佳状态。

抗体孵育的时间与抗体浓度参数需通过预实验摸索调整；其中一抗孵育建议采用 4℃条件下过夜孵育的方式，以提升抗原抗体结合效率。

切片的脱蜡与水化步骤必须充分彻底；添加各类反应液时，需确保液体完全覆盖组织样本；每次更换液体前，需将切片上的洗涤液甩干，但要避免切片出现干燥现象；使用组化笔圈定组织范围时，圈定面积应尽量大一些，防止墨水排斥反应导致切片边缘出现干片。

常见问题

片子着色不均匀？

脱蜡不充分：可将切片置于 60℃烤箱烘烤 20 min，随后立即放入新鲜二甲苯 Ⅰ 中进行脱蜡。

水化不全：需定期配制新鲜的梯度乙醇溶液，保障水化效果。

抗体未混匀：使用移液器将一抗、二抗等试剂充分吹打混匀后再进行孵育。

抗体孵育时切片放置倾斜，导致液体分布不均。

抗体孵育后 PBS 冲洗不充分，残留试剂影响染色均匀度。

制片厚薄不均，或染片盒放置不平整、切片倾斜，造成染色效果差异。

一抗从 4℃拿出后，为什么有人说要 37℃复温，目的是什么？一方面，可避免切片从 4℃低温环境直接放入 PBS 溶液中，减少脱片现象的发生；另一方面，能够促使抗原抗体结合更稳定。该操作并非必需步骤，但对于表达量较低的抗原可能有一定帮助。4℃与 37℃条件下分子运动存在差异，低温环境下分子碰撞概率与运动速度更低，37℃复温可加快抗原抗体结合速度，提升检测敏感性，但同时也可能增加非特异性染色的风险。

切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？

抗体孵育时间过长或抗体浓度过高，可通过缩短一抗、二抗孵育时间，以及适当稀释抗体浓度来改善。

若一抗使用多克隆抗体，易出现非特异性着色，建议更换为单克隆抗体尝试。

肝脏、肾脏等组织中内源性过氧化物酶与生物素含量较高，需通过延长灭活时间、提高灭活剂浓度的方式降低背景染色。

非特异性组分与抗体发生结合，可延长二抗来源动物的免疫血清封闭时间，并适当提高血清浓度，增强封闭效果。

DAB 显色时间过长或显色液浓度过高，需严格把控显色时长与试剂浓度。

PBS 冲洗不充分，残留抗体持续反应导致着色增强，需增加冲洗次数与时长。

标本染色过程中出现干片，极易引发非特异性着色，操作中需全程避免切片干燥。